슬롯사이트교 미디어 미디어(양영솽위링/글글위링/그림) 본교 무료슬롯 머신과/무료슬롯 머신센터 황지웨이 교수팀은 Cas9를 억제하는 항단백질의 새로운 메커니즘을 밝히는 데 중요한 진전을 이루었습니다 관련 결과는 지난 1월 19일 Nature Structural & Molecular Biology에 "An anti-CRISPR Targets the sgRNA to block Cas9 andguides the design of Enhanced Genome Editors"(항CRISPR는 sgRNA를 대상으로 Cas9 차단 및 향상된 게놈 편집기 설계 안내)라는 제목으로 게재되었습니다 본 연구는 Anti-CRISPR 단백질 AcrIIA27이 Cas9 뉴클레아제 활성을 광범위하게 억제하는 분자 메커니즘을 밝히고 CRISPR-Cas9 활성의 정확한 조절을 위한 새로운 이론적 기반을 제공하며 AcrIIA27의 억제 메커니즘을 기반으로 활성이 강화된 게놈 편집 도구를 개발합니다
박테리아는 CRISPR-Cas 적응 면역 시스템을 사용하여 Cas 단백질을 안내하여 파지 핵산을 절단함으로써 파지 침입에 저항하는 가이드 RNA를 구현합니다 파지는 박테리아 CRISPR-Cas 시스템이 Anti-CRISPR를 통해 박테리아를 감염시키는 것을 억제합니다 Anti-CRISPR는 CRISPR-Cas 복합체의 조립을 방해하고 Cas effector 단백질을 번역 후 변형하여 비활성화하는 등 다양한 메커니즘을 통해 CRISPR-Cas 시스템의 기능을 차단하지만, 현재 알려진 Anti-CRISPR 단백질은 모두 Cas 단백질을 표적으로 하여 억제 기능을 달성합니다
이 연구에서 팀은 먼저 생화학적 실험을 통해 SpCas9-sgRNA 복합체에 결합하는 AcrIIA27 단백질이 기질 DNA의 결합을 억제하여 SpCas9 활성을 억제할 수 있음을 발견했습니다 연구진은 SpCas9-sgRNA-AcrIIA27 삼원 복합체의 고해상도 구조를 추가로 분석함으로써 AcrIIA27이 주로 스캐폴드 sgRNA와의 상호작용을 통해 SpCas9-sgRNA 복합체에 결합한다는 사실을 발견했는데, 이는 항단백질이 Cas 단백질과 상호작용하여 Cas 단백질의 활성을 억제하는 이전에 발견된 메커니즘과는 완전히 다른 것이다 연구팀은 SpCas9-sgRNA-DNA와 SpCas9-sgRNA-AcrIIA27 복합체의 구조를 비교한 결과, AcrIIA27이 PTP에 결합하기보다는 기질 PAM(Protospacer Adjacent Motif)(이 글에서는 PAM- 또는 TAM-근위 RNA, PTP라고 함)의 근위 지지체 RNA 루프의 인산염 지지체 영역에 결합한다는 사실을 발견했습니다 RNA의 염기서열과 AcrIIA27의 입체 장애 효과는 기질 DNA가 SpCas9에 결합하는 것을 방지하여(그림 1) SpCas9의 활성을 억제합니다 또한 PTP RNA는 Cas9의 여러 하위 유형의 골격 RNA에 존재하기 때문에 AcrIIA27이 다양한 생식계열 기원의 Cas9 상동체의 활성을 억제할 수 있는지 여부를 계속 테스트했습니다 후속 생화학적 실험에서는 AcrIIA27이 다양한 생식계열 기원의 Cas9 동족체의 활성을 억제하는 능력이 있음을 확인했습니다
그림 1: Cas9 활성을 억제하는 AcrIIA27의 분자 메커니즘
PTP RNA는 유전자 편집에 사용되는 여러 Cas 및 TnpB 시스템에서 보존되므로(그림 2A), 팀은 세포 유전자 편집 응용 분야에서 이 연구에서 발견된 PTP RNA의 인산염 백본이 세포의 특정 양전하를 띤 단백질에 비특이적으로 결합하여 DNA 기질 결합을 억제하고 궁극적으로 Cas 및 TnpB 단백질의 유전자 편집 활동을 억제할 것이라고 추측합니다 이 추측이 사실이라면 PTP RNA를 제거하고 알려지지 않은 단백질의 억제를 해제함으로써 세포에서 위 시스템의 유전자 편집 활성이 향상될 수 있습니다
다음의 세포내 유전자 편집 활동 실험에서는 HEK 293F 세포의 다양한 표적 유전자 부위에서 PTP RNA가 고갈된 SaCas9 및 FrCas9의 편집 효율이 야생형의 편집 효율의 각각 2배 및 13배임을 보여주었습니다(그림 2B) 더 중요한 것은 "PTP RNA" 절단 전략이 더 큰 스캐폴드 RNA를 가진 CRISPR 뉴클레아제 시스템(Cas12f, IscB 등)에도 적용 가능하다는 것입니다 뿐만 아니라, 비CRISPR IS607 TnpB(ISFba1, ISRin 및 ISAre)의 PTP RNA(스템 루프 3)를 제거한 후 HEK 293F 세포에서 유전자 편집 활성이 크게 향상되는 것으로 나타났습니다 그 중 ISFba1 TnpB 시스템의 전반적인 게놈 편집 효율이 2배 증가했습니다 연구팀은 오프타겟 분석을 통해 PTP RNA를 제거하면 ISFba1 TnpB의 표적 특이성도 강화할 수 있다는 사실을 발견했다
그림 2A: CRISPR 및 TnpB 시스템의 PTP RNA
그림 2B: 인간 세포에서 야생형 및 PTP RNA 삭제 SauCas9 및 ISFba1의 유전자 편집 효율성 비교
요약하자면, 이 연구는 항단백질이 Cas 단백질의 활성을 억제하는 새로운 메커니즘을 최초로 발견했으며, 파지와 박테리아의 "군비 경쟁" 공진화에 대한 지식의 경계를 확장했습니다 또한, 연구팀은 이러한 새로운 메커니즘을 기반으로 CRISPR 및 TnpB 유전자 편집의 효율성을 향상시킬 수 있는 일반적인 전략을 제안하여 효율적인 유전자 편집 도구 개발을 위한 새로운 관점과 디자인 아이디어를 제공했습니다
황지웨이 교수가 해당 논문의 교신저자입니다 무료슬롯 머신 및 의학부의 박사과정생 Yu Ling, Yin Mingyu, 부연구원 Zhu Yuwei가 이 논문의 공동 제1저자입니다
이 연구는 국가 핵심 R&D 프로그램, 국립 자연과학 재단, 중앙 정부의 지방 과학 기술 개발 기금 및 Tencent New Cornerstone 과학 기금의 자금 지원을 받았습니다
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